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產(chǎn)品展示
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M-MuLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑

  • 型   號:71117
  • 價   格:
  • 更新時間:2025-04-23
  • 廠家性質(zhì):經(jīng)銷商

本制品使用通過基因重組技術(shù)克隆表達的點突變型RNase H活性缺失的 M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶。野生型的M-MuLV 包含的RNase H活性能夠催化降解DNA/RNA雜合體中的RNA,因此在cDNA第一條鏈的合成反應(yīng)中可能會降解RNA/DNA雜合體中的模板RNA。
M-MuLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑

Script III M-MuLV Reverse Transcriptase


M-MuLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑 

目錄號:71117

產(chǎn)品內(nèi)容

Components

71117-10000

71117-50000

M-MuLV (200U/ μl)

10000 U

50000 U

5x RT Buffer

250 μl

5x 500 μl

保存條件:-20℃保存,有效期 12 個月

產(chǎn)品簡介

本制品使用通過基因重組技術(shù)克隆表達的點突變型RNase H活性缺失的 M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶。野生型的M-MuLV 包含的RNase H活性能夠催化降解DNA/RNA雜合體中的RNA,因此在cDNA第一條鏈的合成反應(yīng)中可能會降解RNA/DNA雜合體中的模板RNA。本酶M-MuLV(RNase Hˉ)的RNase H活性缺失,與M-MuLV 相比,具有更強的延伸能力和穩(wěn)定性,可用于較長的cDNA合成以及高比例的全長cDNA文庫的構(gòu)建等。

適用范圍

第一鏈cDNA合成??捎糜诘涂截惢虻臋z測。

產(chǎn)品特點

合成cDNA片段長度最高可達12 kb。

引物的選擇:

1. 如果RNA模板來源于真核生物,shou選Oligo (dT),與真核生物mRNA的 3’PolyA尾配對,可獲得最高產(chǎn)量的全長cDNA。

2. 如果對一些物種,不能確定mRNA是否有polyA尾的情況下,shou選Oligo (dT),不成功再嘗試基因特異性引物(GSP)和Random primer為引物。

3. 基因特異性引物(GSP)的特異性較高。但有些情況下,用于PCR反應(yīng)的GSP無法有效引導(dǎo)第一鏈cDNA合成,可改用Oligo (dT)或Random primer重新進行逆轉(zhuǎn)錄。

4. Random primer特異性zui低,所有RNA,包括mRNA,rRNA,tRNA均可以作為Random primer的模板。當(dāng)目標(biāo)區(qū)域具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)或GC含量較高,或者模板為原核生物來源,使用Oligo (dT)或基因特異性引物(GSP)無法有效引導(dǎo)cDNA合成時,可使用Random primer為引物。

5. 如果合成cDNA下游用于qPCR,可將Oligo (dT)與Random primer混合使用(各加1μl /20μl反應(yīng)體系),可使mRNA的各個區(qū)域cDNA合成效率相同,有助于提高qPCR結(jié)果的真實性和重復(fù)性。

第一連 cDNA 合成 (以 20 μl 反應(yīng)體系為例)

1.反應(yīng)體系的配制

操作前,請將各組分輕彈混勻,點甩離心收集至管底,置冰上備用。

使用 RNase-Free PCR 管在冰上配制:

Components

Volume

Total RNA

50 ng - 5 μg

Oligo(dT)18 (0.5 μg /μl) or

Random primer (N6) (0.1 μg/μl) or

GSP (Gene Specific Primer , 2 pmol/μl) or

1 μl

1 μl

1 μl

5x RT Buffer

4 μl

RNase Inhibitor (40 units/μl)

0.5 μl

M-MuLV (200U/μl)

1 μl

RNase free H2O

To 20 μl

2.輕柔吸打混勻,點甩離心,置 PCR 儀進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

如用Oligo(dT)18或基因特異性引物(GSP),產(chǎn)物用于PCR:42℃孵育30 min;

產(chǎn)物用于qPCR:42℃孵育15 min。

如用 Random Primer,25℃孵育10 min 后,產(chǎn)物用于 PCR,42℃孵育30 min;

25℃孵育 10 min 后,產(chǎn)物用于 qPCR,42℃孵育 15 min。

注意:如果模板具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)或高 GC 區(qū)域,可以先只加 RNA 模板、引物和 RNase free H2O,混勻,65℃變性 5 min,冰上冷卻,點甩離心后加入其它成分,并將 42℃孵育溫度提升至 50°C,有助于提高產(chǎn)量。

3. 85°C加熱 5 sec,失活RTase和dsDNase,終止反應(yīng)。

逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于PCR或qPCR反應(yīng),或保存于-20°C,并在半年內(nèi)使用;長期存放建議分裝后在-70°C保存,cDNA應(yīng)避免反復(fù)凍融。

PCR

建議取2 - 4 μl的cDNA產(chǎn)物原液作為PCR模板。

1. 常規(guī)擴增:71019-2x Taq PCR MasterMix (30sec/kb)

71800-2x Lightning Taq PCR MasterMix (10sec/kb)

2. 高保真擴增:71812-2x FastHiFi PCR MasterMix (≤3kb片段)

71814-2×LongHiFi PCR MasterMix (≤10kb片段)

qPCR

建議取1~2μl cDNA產(chǎn)物原液作為20μl qPCR反應(yīng)體系的模板。如果基因表

達量較高,請根據(jù)實際情況適當(dāng)稀釋cDNA模板后使用。

相關(guān)產(chǎn)品:

71519 2x SYBR Green qPCR Mix (同TB Green Premix Ex Taq)

71600 2x Universal SYBR Green qPCR Mix (適用于所有qPCR儀)

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91451 高效動物組織/細胞總RNA提取試劑盒 (動物組織、細胞)

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M-MuLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑 

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